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石正麗等中國科學家發現：進化的“軍備競賽”（arms race）塑造了病毒及其受體的多樣性。鑒定涉及種間傳播的關鍵殘基對于預測潛在的病原體、了解病毒如何從野生動物向人類躍遷，都是非常重要的。

以前，研究者已經在中華菊頭蝠中鑒定出具有不同遺傳特征的SARS相關冠狀病毒（SARSr-CoV）。而這份最新研究還展現了中華菊頭蝠種群中蝙蝠受體ACE2（血管緊張素轉化酶2）的高度多樣性。這些ACE2變體支持SARS病毒和SARS相關冠狀病毒的感染，但對不同刺突蛋白具有不同的結合親和力。SARS相關冠狀病毒刺突蛋白對人ACE2擁有更高結合親和力，顯示這些病毒具有向人類躍遷傳染的能力。ACE2和SARS相關冠狀病毒刺突蛋白之間的界面處殘基的正向選擇，表明它們之間存在長期和持續的協同進化動力學。因此，持續監視蝙蝠中的這一組病毒對于預防下一個SARS樣疾病非常必要。

以上研究來自中科院武漢病毒所石正麗團隊與福建師范大學生命科學學院歐陽松應教授在預印本平臺 bioRxiv 上發表的論文：Evolutionary arms race between virus and host drives genetic diversity in bat SARS related coronavirus spike genes。

中華菊頭蝠是SARS病毒的宿主，其體內還攜帶多種SARS相關冠狀病毒。這些病毒具有高度的遺傳多樣性，尤其是病毒的刺突蛋白基因。盡管有著不同程度的變異，一些蝙蝠SARS相關冠狀病毒仍可以利用人類受體ACE2進入人體細胞。研究者推測，蝙蝠的ACE2受體和SARS相關冠狀病毒刺突蛋白之間，有著相互作用，而這驅動了SARS相關冠狀病毒的遺傳多樣性。

研究者鑒定出了一系列中華菊頭蝠ACE2變異體，這些變異體中有一些與SARS-CoV刺突蛋白有相互作用的多態位點。攜帶不同刺突蛋白的偽病毒或SARS相關冠狀病毒，在表達了蝙蝠ACE2變體的細胞中有著不同的瞬時感染效率。通過測定SARS病毒、SARS相關冠狀病毒刺突蛋白與蝙蝠受體、人類受體分子之間的結合親和力，能觀察到相關的結果。

所有被測試的蝙蝠SARS相關冠狀病毒刺突蛋白與人ACE2的結合親和力，均高于其對蝙蝠ACE2的結合親和力。不過SARS相關冠狀病毒刺突蛋白與人ACE2的結合親和力，比SARS-CoV刺突蛋白與人ACE的親和力低10倍。

結構建模表明，刺突和ACE2之間的結合親和力差異可能是由于這兩個分子界面中某些關鍵殘基的改變而引起。分子進化分析表明，這些殘基處于強的正選擇。

這些結果表明SARS新冠病毒刺突蛋白和蝙蝠ACE2可能隨著時間的推移而互相進化，并經歷彼此的選擇壓力，從而觸發了進化的“軍備競賽”動力學。這進一步證明了，中華菊頭蝠是SARS相關冠狀病毒的天然宿主。

冠狀病毒是包膜病毒，包含單股正鏈RNA。該亞科有四個屬，即α、β、γ和δ。α冠狀病毒和β冠狀病毒起源于蝙蝠或嚙齒動物，而γ冠狀病毒和δ冠狀病毒起源于鳥類。自21世紀初以來，三種β型冠狀病毒已引起人類嚴重肺炎暴發。分別是SARS-CoV，MERS-CoV和SARS-CoV-2。

SARS-CoV-2引發的疫情使人們回想起17年前發生的SARS疫情。SARS是一種人畜共患病，在接下來的幾年中，科學家從中國和歐洲不同地區的蝙蝠中檢測或分離出了具有不同遺傳特征的75種SARS相關冠狀病毒（SARSr-CoV）。

蝙蝠SARS相關冠狀病毒與人類和果子貍的SARS-CoVs有96％的核苷酸序列相似度，其中可變區最多的是刺突蛋白（S）和輔助蛋白ORF3和ORF8。此外，研究者已經確定了不同蝙蝠SARS相關冠狀病毒基因組中能找到SARS-CoV的所有基因構建基塊，這表明SARS病毒的祖先是通過蝙蝠SARS相關冠狀病毒基因組的重組而來，其起源于蝙蝠。

病毒感染的第一步是識別細胞受體，這也是必不可少的步驟。冠狀病毒的進入是由病毒刺突蛋白（Spike，S）和細胞表面受體之間的特異性相互作用介導，然后病毒與宿主膜之間發生融合。冠狀病毒刺突蛋白在功能上分為兩個亞基：細胞附著亞基（S1）和膜融合亞基（S2）。 S1區域包含N端結構域（NTD）和C端結構域（CTD）；兩者均可用于冠狀病毒受體結合（RBD）。

對于SARS-CoV，其S1-CTD作為RBD與細胞的受體即血管緊張素轉換酶2（ACE2）結合。冷凍電鏡和晶體結構分析，確定了SARS病毒的S-RBD與人ACE2之間界面中的一些關鍵殘基。

根據S蛋白的大小，蝙蝠SARS相關冠狀病毒可以分為兩個不同的進化枝。進化枝1包含病毒具有與SARS病毒大小相同的刺突蛋白。而由于5、12或13個氨基酸缺失，屬于進化枝2的病毒其刺突蛋白則比SARS病毒的小。

盡管RBD有所不同，所有進化枝1毒株都可以使用ACE2進入細胞，而進化枝2毒株則由于上述缺失無法直接進入。這些結果表明，就基因組相似性和ACE2的使用而言，進化枝1的成員很可能是SARS病毒的直接來源。

ACE2在功能上分為兩個結構域：N末端結構域參與SARS-CoV結合，C末端結構域參與心功能的調節。先前的結果表明，不同來源的ACE2的C末端結構域相對保守，而N末端結構域在物種間顯示出更多的多樣性。此前已證明SARS病毒可以利用水鼠耳蝠的ACE2和中華菊頭蝠的ACE2。RBD結合位點中的微小突變，可將ACE2從對SARS-CoV結合不易感轉變為易感。由于屬于進化枝1的所有SARS相關冠狀病毒都可從中華菊頭蝠體內提取出來，而且也都可以利用ACE2，因此研究者提出問題：中華菊頭蝠ACE2中的變異是否可能有導致了蝙蝠SARS相關冠狀病毒的多樣性。

研究團隊研究了中華菊頭蝠ACE2基因的多態性，并通過分子進化分析，蛋白質親和力測定和病毒感染測定相結合，評估了它們對不同蝙蝠SARS相關冠狀病毒刺突蛋白的敏感性和結合親和力。

結果表明，SARS相關冠狀病毒的刺突蛋白多樣性可能會受到中華菊頭蝠ACE2變體的自然選擇壓力； 在長期共存期間，SARSr-CoV刺突蛋白可能會被中華菊頭蝠的ACE2選擇，以維持自身遺傳多樣性并適合中華菊頭蝠的種群。

ACE2基因在中華菊頭蝠種群中表現出高度多態性

根據蝙蝠SARS相關冠狀病毒的流行情況以及樣品組織的可用性和質量，研究者使用來自三個省（湖北，廣東和云南）的樣品進行ACE2擴增。

除了團隊先前測序過的蝙蝠ACE2（分別從湖北，廣西和云南收集的樣本ID 832、411和3357）和其他蝙蝠ACE2（GenBank登記號ACT66275，這是從香港收集的樣本）外，研究者從21只中華菊頭蝠蝠個體中獲得了ACE2基因序列：湖北有5個，廣東有9個，云南有7個。這些蝙蝠ACE2序列在其物種內顯示98-100％的氨基酸同一性，與人ACE2的顯示80-81％的氨基酸同一性。

這些蝙蝠ACE2在N端區域觀察到了主要變化，包括一些先前已確定與SARS病毒的 S-RBD接觸的殘基。根據非同義SNP分析鑒定出8個殘基，包括24、27、31、34、35、38.41和42。這8個殘基的組合產生了8個等位基因，包括RIESEDYK，LIEFENYQ，RTESENYQ，RIKSEDYQ，QIKSEDYQ， RMTSEDYQ，EMKT KDHQ和EIKT EIKTKDHQ，分別命名為等位基因1-8。

除了先前研究（等位基因4、7和8）中的ACE2基因型數據外，研究者在中華菊頭蝠種群中還鑒定出5個新的等位基因。“等位基因2”在兩個省的樣本中有發現，“等位基因4”在3個省中有發現，而其他等位基因似乎在地理上受到限制。總之，在廣東發現了3個等位基因（4、6和8），云南發現了4個等位基因（1、2、4和7），在湖北發現了3個等位基因（2、4和5），在廣西和香港分別找到了1個等位基因。在發現SARS病毒直接祖先的云南一蝙蝠洞中，研究者發現了4個等位基因共存。

綜上所述，這些數據表明ACE2變異體已經在不同地區的中華菊頭蝠種群中長期存在。與SARS病毒的S-RBD直接接觸的位點的取代，表明它們在SARS病毒的進化和傳播過程中可能具有重要功能。

中華菊頭蝠ACE2變體對SARS相關冠狀病毒感染表現出的不同敏感性

為了評估不同的中華菊頭蝠ACE2分子是否會影響SARS病毒和蝙蝠SARS相關冠狀病毒的進入，研究者在HeLa細胞中瞬時表達了中華菊頭蝠的ACE2的變體，并測試了攜帶不同刺突蛋白的SARS病毒偽型或蝙蝠SARS相關冠狀病毒的進入效率。

4株蝙蝠SARS相關冠狀病毒按照S1序列可分為4個基因型。簡單地說，與SARS病毒的刺突蛋白相比，SARS相關病毒RsWIV1的RBD與SARS病毒具有氨基酸高度同一性；RsWIV16是SARS病毒的近親，在NTD和RBD均表現氨基酸高相似；Rs4231在NTD上與SARS病毒有著高度的氨基酸相似度；而RsSHC014在NTD和RBD區域與SARS病毒均有差異。

與之前的研究結果類似：所有四株具有相同基因組背景但不同刺突蛋白的蝙蝠SARS相關冠狀病毒毒株，都可以利用人類ACE2進行相似水平的復制。

然而，它們在如何利用中華菊頭蝠ACE2方面存在一些差異。所有測試病毒都能有效利用等位基因1、2、4、5進入。具有相同RBD的RsWIV1和RsWIV16則不能使用來自廣東的等位基因6(樣本ID 1434)。具有相同RBD的Rs4231和RsSHC014不能分別使用來自云南和廣東的等位基因7(樣本ID 3357)和等位基因8(樣本ID 1438)。SARS病毒BJ01與WIV1和WIV16的RBD有很高的相似性，能夠在假型感染實驗中使用與Rs4231和RsSHC014相同的蝙蝠ACE2等位基因。

這些結果表明，病毒進入細胞都受到刺突RBD和中華菊頭蝠 ACE2變異體的影響。

蝙蝠ACE2殘基突變會影響其與SARS相關冠狀病毒RBD的結合親和力

為進一步了解SARS病毒和SARS相關冠狀病毒對ACE2使用能力不同，研究者表達了冠狀病毒BJ01、RsWIV1、RsWIV1、RsSHC014的RBD，和3個中華菊頭蝠的ACE2，分別是等位基因6(樣本1434)，等位基因7(樣本3357)和等位基因2(樣本5720)。

隨后，研究者測試它們之間的親和力。陽性對照為SARS病毒BJ01的RBD 與人ACE2，陰性對照為SARS病毒RsWIV1的RBD 與人DPP4。實時分析表明，基于平衡解離常數KD，不同RBD與ACE2的結合親和力不同。

與病毒感染實驗結果一致，發現1434ACE2(等位基因6)與RsSHC014和BJ01結合，而與RsWIV1的RBD不結合；研究還發現3357ACE2(等位基因7)與RsWIV1結合，但不與RsSHC014和BJ01的RBD結合；5720ACE2(等位基因2)被發現能結合所有測試的RBD。所有被測試的RBD都與人類或蝙蝠ACE2具有很高的結合親和力。然而，與兩種蝙蝠SARS相關冠狀病毒的RBD相比，它對中華菊頭蝠ACE2的結合親和力較低。

這些結果表明，刺突RBD與ACE2的結合親和力影響病毒的感染能力。

SARS相關冠狀病毒RBDs與中華菊頭蝠ACE2s相互作用的結構模型

4個蝙蝠SARS相關冠狀病毒的刺突蛋白大小相同，與SARS-CoV的氨基酸同源性超過90%，表明這些蛋白具有228個相似的結構。在本研究中，他們使用中華菊頭蝠ACE2 3357（等位基因7)構建了蝙蝠SARS相關冠狀病毒RsSHC014 RBD的結構復雜模型，并用中華菊頭蝠ACE2 1434(等位基因6)構建了蝙蝠SARS相關冠狀病毒RsWIV1 RBD的結構復雜模型。

這與SARS-CoV RBD與人類ACE2的結合親和實驗結果一致。與SARS-CoV RBD和人類ACE2界面的接觸殘基相比，可以觀察到ACE2上的兩個病毒病毒結合熱點(hotspot hotspot Lys31和Lys353分別由Glu35和Asp38組成的鹽橋)或附近的變化。如前所述，這兩個熱點隱藏在疏水環境中。它們為病毒-受體結合相互作用提供了大量的能量，并填補了結合界面上疏水性疊加238相互作用的關鍵空隙。

與人ACE2相比，中華菊頭蝠ACE2-3357的兩個主要殘留變化是E35K和Y41H。E35K與RsSHC014 RBD中K31和Arg479的鹽橋斷裂，可能影響它們之間的結合親和力。41位置的組氨酸可能會削弱K353- d38鹽橋的支撐力，因為組氨酸比酪氨酸的疏水性更弱，導致其與BJ01 RBD的結合親和力降低。因此，BJ01和RsSHC014 RBD與中華菊頭蝠ACE2 -3357的結合親和力較低。

在中華菊頭蝠ACE2-1434中，位置31發現了蘇氨酸，這與人類ACE2的這個位置不同，人類的是賴氨酸。雖然K31T的變化導致其不能與Glu35形成鹽橋，但BJ01的RBD c中的Tyr442可以與之形成氫鍵。但RsWIV1 RBD中位于442的絲氨酸則不具備這種功能。

此外，RsSHC014含有一個位于479的精氨酸，Thr31不能與Glu35形成鹽橋，使Glu35可以與Arg479形成鹽橋，但RsWIV1中的RBD殘基Asn479可能會導致其失去這一能力。因此，BJ01和RsSHC014 RBD可以與中華菊頭蝠ACE2 -1434結合，但RsWIV1RBD無法與中華菊頭蝠的ACE2 -1434結合。

本研究中所有的中華菊頭蝠 ACE2在82的位置都包含一個天冬酰胺，而人類ACE2在此位置則是蛋氨酸。M82N的變化引入了一個不利的親水殘基，削弱了熱點31周圍的疏水網絡。此外，Asn82引入了一個糖基化位點，就像在大鼠ACE2中一樣，導致其不能有效支持SARS-CoV感染；ACE2在82位置上的聚糖可能導致空間干擾病毒RBD結合。

因此，M82N可能對SARS-CoV及SARS相關冠狀病毒RBD與中華菊頭蝠ACE2s的相互作用有顯著影響。如前所述，RBD的487殘基與ACE2上的熱點353相互作用。RsWIV1 RBD中含有Asn487, Asn487的極性側鏈可能與ACE2中Lys353殘基的脂肪族部分發生不利的相互作用，影響K353與D38的熱點相互作用。

此外，RsSHC014 RBD在位置487含有一個丙氨酸；Ala 487的小側鏈不支持熱點353的結構。因此，RsWIV1及RsSHC014 RBD與人類ACE2的結合親和力均低于BJ01，但與人類ACE2的結合親和力均高于中華菊頭蝠ACE2，這與病毒感染和結合實驗結果高度相符。

SARSr-CoV刺突基因通過正向選擇與中華菊頭蝠ACE2共同進化

為了測試作用于SARS病毒刺突蛋白和中華菊頭蝠ACE2基因可能存在的選擇壓力，他們使用PAML軟件包的編碼ml程序來分析單個密碼子的非同義突變與同義突變的比值(dN/dS比值)。通過分析了完整的編碼SARS相關冠狀病毒刺突蛋白的基因序列，并比對了來自中華菊頭蝠樣本的9個SARS相關冠狀病毒刺突蛋白的基因序列。

研究發現模型允許密碼子在正向選擇(M2a和M8)下進化。在模型M8(初始種子值ω(dN / dS) = 1.6,密碼子頻率= F3X4), 20個密碼子(p > 0.95)以dN / dS > 1的速率正向選擇，根據晶體結構顯示，298個密碼子中有17個被發現位于RBD區域，面向受體ACE2。此外，在SARS-CoV刺突中出現的5個密碼子(442、472、479、480和487)，此前已被確定對人類ACE2的結合親和力有顯著影響。

接下來，他們通過比對本研究獲得的以及從GenBank下載的25個中華菊頭蝠ACE2基因序列，對中華菊頭蝠ACE2基因進行分析。他們發現在模型M8中，12個密碼子(2.3%,p > 0.95)以dN / dS > 1的速率進行正向選擇，其中8個密碼子(31、24、27、34、35、38、41、42)對應于人類ACE2的殘留物，這些密碼子直接參與人類SARS病毒刺突蛋白的接觸。

他們還分析了中菊頭蝠(R. affinis)的ACE2基因，有報道稱該基因偶爾也能結合SARS相關冠狀病毒。利用本研究獲得的23個來自中菊頭蝠的ACE2基因序列比對，發現中菊頭蝠ACE2在整個編碼區不同個體間的保守性比中華菊頭蝠ACE2更強，并且沒有觀察到明顯的正向選擇位點(數據未顯示)。

此外，通過查詢單核苷酸多態性(SNP)數據庫，他們發現人類ACE2基因中的SNPs在整個編碼區域隨機產生。雖然在人類ACE2中發現了兩個具有非同義突變(T27A和E35K)的SNP位點，但它們在全球人群中都顯示出罕見的頻率(頻率分別為0.00001和0.00002)。這些結果表明，在蝙蝠SARS相關冠狀病毒刺突蛋白與中華菊頭蝠ACE2的交界面發生了正向選擇。